荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)荧光共振能量转移（FRET)是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程。此过程没有光子的参与，所以是非辐射的。该分析方法具有快速、敏感和简单等优点。 用于FRET试验的染料是可以相同的。但在大多数应用中其实是使用不同的染料。简单地说，荧光共振能量转移是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体（染料1）向受体（染料2）转移的过程。通常，供体 （Donor）荧光基团的发射光谱要与受体（Acceptor）基团的吸收光谱有一定的重叠。当这两个荧光基团间的距离合适时（10 – 100 Å)），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。能量转移发生方式依赖于受体的化学结构：
一个供体基团（EDANS）和接受基因（DABCYL）均被连接到一HIV蛋白酶的天然底物上，当该底物未被切断时，DABCYL可淬灭EDANS，从而检测不到荧光。当该底物被HIV-1蛋白酶切断后，EDANS不再被DABCYL淬灭，随即可检测到EDANS荧光。蛋白酶抑制剂的有效性可凭借EDANS荧光强度的变化进行监测。
FRET肽是研究肽酶特异性的便利工具，由于其反应过程可被连续监测，为酶活性的检测提供了一个便捷的方法。供体/受体对的肽键水解后产生的荧光可衡量纳摩尔级浓度的酶活性。当FRET肽是完整的，表现出的是内部的荧光猝灭，但当供体/受体对的任何肽键断裂就会释放出荧光，此荧光可被连续检测，从而可对酶的活性进行定量分析。 FRET 肽可作为各类酶研究的合适底物，比如：
以下是一些用于FRET的标准染料组合::
在蛋白酶的多肽底物内经共振能量转移引发荧光猝灭的供体-接受对
常规RET供体-接受对的福斯特临界距离（Forster Critical Distance）
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FITC
异硫氰酸荧光素（FITC）与羧基荧光素相比更具活性，而且后者需要被激活才能使用。FITC主要是与巯基反应，如还原型半胱氨酸的侧链，尤其是多肽或蛋白中的氨基。
对众多应用来说，在化学合成过程中引入荧光标记是很容易的。 如在固相合成过程中，FITC可以与赖氨酸（Lys）或被选择性地脱保护的鸟氨酸（ornithine）侧链，或合成过程中的多肽N端氨基反应。当在N端标记时，建议在最后一个氨基和由异硫氰酸酯与氨基反应产生的硫脲键之间引入烷基间隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。 链接切割需要酸性环境，在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的肽从树脂上切下来时，这种情况可避免。 空间位阻被认为是在荧光染料前使用Ahx的主要原因，而不是为什么FITC不能直接偶联在多肽上的原因。Ahx或b-Ala均可作为间隔器用于FITC标记的多肽上。
通常，生物素、FITC等染料可任意标记在多肽N端或C端。但我们推荐N端标记，其成功率更高、所需时间更短、更易操作。由于多肽都是从C端往N端合成，所以N端修饰将是固相合成的最后一步，不再需要额外的偶联步骤。相反，如果是C端标记，则需要附加步骤，而过程会更复杂。 大多数染料都是大型的芳香分子，如此庞大分子的介入有助于避免标签和多肽之间的相互作用。这将有助于保持多肽的构象和生物学活性。一般来说，推荐引入一个柔性间隔如Ahx(一个6碳化合物)会使荧光标记更加稳定。否则FITC将很容易与其他任何位置的半胱氨酸的巯基或赖氨酸的氨基发生连接。
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多肽合成常见问题解答（FAQs）荧光标记时，肽和修饰标记的染料之间是否需要添加一个间隔？ 如何溶解多肽? 我该如何选择适合自己研究的最佳纯度？ |
成功案例1这个事例阐述了用于FRET检测的基本方法。荧光分子methoxycoumarine acetic acid（MCA)被标记在多肽的N端，该多肽被设计作为及基质金属蛋白酶溶基质素的底物，在易断裂的Gly-Leu肽键（可被酶水解）之后，连接猝灭剂N-3-(2, 4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropionyl（DPA）(Knight el al., 1992)。 完整多肽序列如下: MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2 MCA的最大吸收峰是328nm，最大发射峰是393nm。 DPA基团在363nm处有很强的吸收谱，并在410nm处有明显的肩峰。该肩峰与MCA荧光谱重叠，从而导致了显著的荧光猝灭。 研究发现，1μm MCA-Pro-Leu（酶解产物）溶液的荧光量是等量MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2溶液的130倍，其激发波和发射波分别为328nm、 393nm。 多肽酶解导致了MCA与DPA基团的分裂，因而MCA荧光大大地增强。荧光增强可随着时间变化地跟踪，并可以此度量反应速度，研究者借此可以确立该肽作为几个及基质金属蛋白酶家族成员的底物的Kcat/Km值。此检测方法最近被用来测定溶基质素的潜在抑制能力，即通过酶反应的初速度来衡量抑制效果 (Copeland et al., 1995)。 成功案例2客户定制了一个疏水性很高的68aa多肽（纯度>85%），同时荧光素FITC被标记在该多肽的N端。此多肽合成仅花了4周时间。 HPLC 分析:
MS 分析:
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